Die entwickelte Methode zur Bestimmung spezifischer Aminosäuren wie Homocystein, Valin, Leucin und Tyrosin im Blutplasma mittels ARACUS Aminosäureanalysator ermöglicht eine präzise Differenzierung zwischen gesunden und erkrankten Patienten. Erhöhte Homocysteinspiegel wurden bei Myokardinfarkt-Patienten nachgewiesen, während bei Typ-2-Diabetes signifikante Veränderungen im Profil verzweigtkettiger und aromatischer Aminosäuren beobachtet wurden. Die Methode bietet somit ein zuverlässiges analytisches Instrument zur Früherkennung kardiovaskulärer und metabolischer Erkrankungen.
Methode zur Bestimmung der Aminosäuren bei Myokardinfarkt und Diabetes Typ 2 mit dem ARACUS
Ziel der Studie war die Entwicklung und Validierung einer Methode zur Bestimmung der Aminosäuren Homocystein, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin und Phenylalanin im menschlichen Blutplasma. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Ursache für Todesfälle. Studien der letzten 10 bis 20 Jahre haben gezeigt, dass ein erhöhter Homocysteinspiegel ein Marker für das Risiko von Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist. Homocystein ist eine Aminosäure, die im Plasma gemessen wird, und die normalen Werte liegen im Bereich von 5 – 15 nmol/ml Blutplasma.
Erhöhte Plasmahomocysteinwerte werden mit endothelialer Dysfunktion, oxidativem Stress und erhöhter Thrombogenität in Verbindung gebracht, was zur Entwicklung von Atherosklerose beiträgt (Refsum et al., 2006).
Probenvorbereitung und Analyse
500 µl Blutplasma und 100 µl 4%ige Dithiothreitol-Lösung wurden in einem 1,5-mL-Röhrchen gemischt und 30 Minuten lang bei 40° bebrütet. Gebundene Formen von Homocystein in der Probe werden durch die Verwendung von 4%iger Dithiothreitol-Lösung in Form von freiem Homocystein reduziert. Nach der Inkubation werden 150 µL der Fällungslösung zugegeben und für 20 min im Kühlschrank zur Proteinfällung gelagert. Dann wurden 500 µL Probenverdünnungspuffer (einschließlich des internen Standards Norleucin, 100 nmol/mL) zugegeben und gemischt. Der Überstand wurde mit einem membraSpin durch Zentrifugation bei 14000 rpm für fünf Minuten filtriert. Die partikelfreie Lösung wurde für die Injektion verwendet.
Die Proben wurden mit dem Aminosäureanalysator ARACUS analysiert, der von der membraPure GmbH hergestellt und weltweit vertrieben wird. Der ARACUS verwendet die klassische Routineanalyse von Aminosäuren durch Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin und die Detektion bei 440 nm und 570 nm.
Die Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin ist eine gut etablierte Methode zur genauen Quantifizierung von Aminosäuren, einschließlich Homocystein, in klinischen Proben (Cohen & Michaud, 1993).
Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen die Ergebnisse von Patienten ohne und Patienten mit Myokardinfarkt. Die Homocysteinkonzentration ist bei Patienten mit Myokardinfarkt erhöht.
Erhöhtes Homocystein bei Herzinfarktpatienten korreliert nachweislich mit erhöhten Entzündungsmarkern und einem größeren kardiovaskulären Risiko (Lentz, 2005).
Tabelle 3 und Tabelle 4 zeigen die Ergebnisse von Patienten ohne und Patienten mit Diabetes Typ 2. Die Konzentration der AA Leucin und Tyrosin steigt an und der Phenylalaninspiegel sinkt. Homocystein steigt an, so dass Patienten mit Diabetes Typ 2 auch ein höheres Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben.
Ein höherer Gehalt an verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAAs) wie Leucin und Isoleucin sowie an aromatischen Aminosäuren wie Tyrosin wird mit Insulinresistenz und der Entwicklung von Typ-2-Diabetes in Verbindung gebracht (Newgard et al., 2009).
Tabelle 1: Aminosäurekonzentration von Valin, Homocystein, Methionin, Allo-Isoleucin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin und Phenylalanin in nmol/ml Plasma von Patienten ohne Myokardinfarkt.
Tabelle 2: Aminosäurekonzentration von Valin, Homocystein, Methionin, Allo-Isoleucin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin und Phenylalanin in nmol/ml Plasma von Patienten mit Myokardinfarkt.
Tabelle 3: Aminosäurekonzentration von Valin, Homocystein, Methionin, Allo-Isoleucin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin und Phenylalanin in nmol/ml Plasma von Patienten ohne Diabetes Typ 2.
Tabelle 4: Aminosäurekonzentration von Valin, Homocystein, Methionin, Allo-Isoleucin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin und Phenylalanin in nmol/ml Plasma von Patienten mit Diabetes Typ 2.
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Quellen:
- Cohen SA, Michaud DP. „Synthesis of a fluorescent derivatizing reagent, 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, and its application for the analysis of hydrolysate amino acids via high-performance liquid chromatography.“ Anal Biochem. 1993;211(2):279-287.
- Vinod Wali, et al. (2012) Serum Homocysteine Levels As a Novel Biomarker in Patients with Acute Myocardial Infarction. International Journal of Medical and Health Sciences. October 2012, Vol-1.
- Metabolite Profiles and the Risk of Developing Diabetes. Thomas J. Wang, et al. Nat Med. 2011 April; 17(4): 448–453.
- Refsum H, et al. „Homocysteine and cardiovascular disease.“ Annu Rev Med. 2006;57: 625-654.
- Lentz SR. „Mechanisms of homocysteine-induced atherothrombosis.“ J Thromb Haemost. 2005;3(8):1646-1654.
- Newgard CB, et al. „A branched-chain amino acid-related metabolic signature that differentiates obese and lean humans and contributes to insulin resistance.“ Cell Metab. 2009;9(4):311-326.