Bestimmung der Aminosäuren in Zellkulturmedien

Die Validierung der Analysemethode soll zeigen, dass sie für die Bestimmung von Aminosäuren in Zellkulturmedien geeignet ist.

Probenvorbereitung und Analyse

Validierung/Präzision:

100 µL der Probe wurden mit 100 µL internem Standard Norleucin (10 µmol/mL) und 600 µL Probenverdünnungspuffer gemischt. 200 µL der Fällungslösung wurden hinzugefügt und für 20 Minuten im Kühlschrank für die Proteinfällung aufbewahrt. Die Probe wurde 5 Minuten lang bei 14000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand mit einem membraSpin durch Zentrifugation bei 14000 rpm für fünf Minuten filtriert. Die partikelfreie Lösung wurde für die Injektion verwendet. Für die Analyse wurden 100 µL der Probe mit 900 µL Probenverdünnungspuffer verdünnt (Verdünnung 1:100).

Genauigkeit/Wiederfindung:

Für die Analyse wurden 2 mL der Probe und 2 mL des Probenverdünnungspuffers (einschließlich Norleucin, 10 µmol/mL) gemischt und mit Probenverdünnungspuffer 1:50 verdünnt. Die erhaltene Stammlösung wurde für die Verdünnungsreihen von 100 %, 80 %, 60 %, 40 %, 20 % und 10 % verwendet.

Tabelle 1: Verdünnungsreihen der Stammlösung für die Validierung der Genauigkeit.The aim is that the validation of the analytical method should demonstrate that it is suitable for the determination of amino acids in cell culture media.

Die Proben wurden mit dem Amino Acid Analyzer ARACUS analysiert, der von der membraPure GmbH hergestellt und weltweit vertrieben wird. Der ARACUS verwendet die klassische Routineanalyse von Aminosäuren durch Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin und die Detektion bei 440 nm und 570 nm.

Validierung/Präzision

Die Präzision der Methode wurde durch die Wiederholbarkeit (innerhalb eines Tages) (Tabelle 2 & Tabelle 3) und die mittlere Präzision (zwischen zwei Tagen) (Tabelle 4 & Tabelle 5) bestimmt. Die Intra-Tages-Präzision wurde als relative Standardabweichung (RSD) der Ergebnisse von zehn Durchläufen der Probe am selben Tag berechnet, und die Inter-Tages-Präzision wurde durch die Probenvorbereitung an zehn verschiedenen Tagen untersucht. Es wurden zehn Probenlösungen hergestellt, und die Standardabweichung (SD) und die RSD (Variationskoeffizient CV %) wurden berechnet.

Tabelle 2: Intra-Tages-Präzision der Aminosäuren in Zellmedienkonzentration in nmol/g (n=10)

Tabelle 3: Intra-Tages-Präzision der Aminosäurekonzentration im Zellmedium in mg/g (n=10)

Tabelle 4: Präzision der Aminosäurekonzentration in Zellmedien zwischen den Tagen in nmol/g (n=10)

Tabelle 5: Präzision der Aminosäurekonzentration in Zellmedien zwischen den Tagen in mg/g (n=10)

Genauigkeit (Wiederfindung)

In dieser Validierungsstudie wurde die Genauigkeit der Methode untersucht, indem die Wiederfindungswerte berechnet wurden, die durch die Analyse der mit Norleucin-Standard (100 µl/ml) vorbereiteten Probe erhalten wurden und 100%, 80%, 60%, 40%, 20% und 10% entsprechen (Tabelle 6).

Tabelle 6: Wiederfindungswerte für Verdünnungsreihen für jede Aminosäure, die in Zellkulturmedien analysiert wurden.

Linearität

Die Linearität ist wichtig für die Bestätigung der Empfindlichkeit der Methode bei der Analyse der Aminosäurekonzentration innerhalb eines bestimmten Bereichs.

Die Linearität ist die Fähigkeit, Testergebnisse zu erhalten, die direkt proportional zur Konzentration der Aminosäure sind. Die Linearität wurde durch fünf Injektionen von sechs verschiedenen Konzentrationen (Injektionsvolumen 5 µl, 10 µl, 20 µl, 30 µl, 40 µl, 50 µl) bestimmt. Die durchschnittlichen Peakflächen wurden gegen die Konzentrationen aufgetragen. Anschließend wurde die Linearität anhand der Kalibrierungskurve bewertet, um den Korrelationskoeffizienten zu berechnen (Tabelle 7). Im Allgemeinen wird ein Korrelationskoeffizient (R2) > 0,990 als Beweis für eine akzeptable Anpassung der Daten an die Regressionslinie angesehen.

Tabelle 7: Ergebnis der Linearität beim Auftragen der durchschnittlichen Peakfläche gegen verschiedene Konzentrationen von Aminosäuren.

Tabelle 8: Nachweis- und Bestimmungsgrenze für jede Aminosäure, die in Zellkulturmedien analysiert wurde.

^{Abbildung 2: Überlappung von drei Chromatogrammen des Aminosäurenstandards.}

^{Abbildung 3: Überlappung von drei Chromatogrammen einer Zellmedienprobe.}

^{Abbildung 4: Überlappung eines Chromatogramms des Aminosäurenstandards und eines Chromatogramms der Zellmedienprobe.}

Schlussfolgerung

Die Methode wurde anhand verschiedener Validierungsparameter wie Richtigkeit, Präzision und Linearität validiert. Es wurde festgestellt, dass alle Validierungsparameter innerhalb der Akzeptanzkriterien liegen. Es zeigt sich, dass die Methode präzise, genau, linear, reproduzierbar und wiederholbar ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Methode praktische Anwendung für die Analyse von Aminosäuren in Zellkulturmedien finden könnte.

Referenzen

Salazar, M. Keusgen, J. von Hagen, Amino Acids in the cultivation of mammalian cells, Amino Acids (2016) 48:1161-1171.